Opuntis merupakan tumbuhan yang habitat aslinya di gurun. Opuntis memiliki banyak species. Untuk mengidentifikasi jenis dari Opuntis, maka dibutuhkan metode yang tepat untuk menganalisis Opuntis, salah satunya melalui DNA barcode yang gennya terdapat pada kloroplas. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh DNA Barcode berbasis DNA kloroplas (cpDNA) untuk Identifikasi Variasi Genetik Opuntis sp. Metode yang dipakai yaitu dengan analisis in silico, sekuens dari species Opuntis diperoleh dari NCBI dengan lokus yang dipakai yaitu rbcL, ndhF, dan matK. Setelah dilakukan pengumpulan data dari NCBI, dilakukan alignment menggunakan aplikasi MEGA 11 dengan memilih clustalW, setelah disejejerkan dibuat rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode neighbor-joining (NJ). Dari penelitian ini didapatkan bahwa gen ndhF mampu membedakan species Opuntis sampai tingkat species, sedangkan gen rbcL dan gen matK memperlihatkan homologi yang tinggi pada hasil penjajaran. Berdasarkan hasil penelitian adalah Gen ndhF bisa digunakan dalam mengindentifikasi variasi genetic tingkat keragamannya yang tinggi.